旋毛蟲通用探針法熒光PCR檢測試劑盒操作流程:

1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,各區(qū)實驗服、儀器 、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。

3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。

5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū),并單獨存放。

6. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。

7. 儀器 擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置;不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

9. 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。產品僅供科研使用

熒光染料的缺點：

不能區(qū)分不同的雙鏈DNA

引物二聚體會影響檢測的敏感性

非特異性產物會影響結果的敏感性

引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別，進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決。總的來說，SYBR Green I方法是一種基礎也的Real-time qPCR實驗手段。